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傳統的蛋白質組技術，如iTRAQ、TMT或者label-free等，採用的是DDA（data-dependent acquisition，資料依賴採集）資料採集方式，其策略是對響應最高的部分母離子進行二級採集。而新一代的蛋白質組學技術DIA（Data Independent Acquisition，資料非依賴採集）採用了不同的資料採集模式：將質譜整個全掃描範圍分為若干個視窗，然後對每個視窗中的所有離子進行檢測、碎裂，從而無遺漏、無差異地獲得樣本中所有離子的資訊，實現了從傳統的機槍掃射的方式嚮導彈轟炸方式的採集方式轉變。
DIA（Data Independent Acquisition，資料非依賴採集）作為新一代的蛋白質組學技術，憑藉其導彈轟炸式的全掃描資料採集方式，顯著提升了蛋白質組學分析的覆蓋度、重現性和準確性，已被眾多頂級研究應用，並發表於Cell、Science、Nature Medicine、Circulation等雜誌。更重要的是，DIA已經應用於眾多國家級的精準醫療專案，如“癌症登月計劃”、“蘇黎世癌症地圖”、“ProCan專案”等。
上海中科新生命經過長期的潛心研發，已在血液樣本蛋白質組學分析方面實現新突破：基於DIA技術，在常規2h分析時長、無需去除血液高丰度蛋白、無需分級的情況下，實現了單個樣本定量>1000個蛋白！！！其中線性範圍跨越5-6個數量級。該分析能力，比相同分析條件下的傳統蛋白質組分析技術（如iTRAQ、TMT或label-free）的資料量提升不止2倍，也使得服務行業中DIA技術在分析能力方面有了質的提升！
中科新生命本次在血液蛋白質組學上的技術突破獲得了行業內的廣泛關注，也非常希望同對DIA技術感興趣的老師與同行，進行廣泛溝通與交流，共同推動技術發展與進步。我們整理了幾個最為關注的問題與大家共享：
出發點：針對血液樣本進行DIA深度開發的意義在哪？
重要性：血液樣本毫無疑問是臨床醫學研究最重要、最高頻分析的樣本型別，尤其在標誌物研究方面具有無可替代的地位。
傳統技術的瓶頸：血液樣本是蛋白質組分析的難點，因為血液中的白蛋白、IgG等高丰度蛋白佔據了90%以上的含量，而質譜會反覆掃描這些高丰度蛋白，導致有意義的低丰度蛋白被採集到的過少。因此，為了能夠檢測到更多、更有意義的蛋白質，在傳統的蛋白質組學的分析模式下，目前的常規策略是：先透過親和方法去除高丰度蛋白，再透過大量的預分級進行檢測。該分析模式的問題在於：
（1） 關於高丰度蛋白的去除問題：高丰度蛋白本身雖然不是大家研究的物件，但卻是重要的載體，血液中非常多的蛋白、代謝分子都會與高丰度蛋白結合。高丰度蛋白去除的同時，很多與其結合的蛋白也會被去除。因此，高丰度蛋白的去除過程對實驗結果的真實性、準確性有一定的影響。有資料表明，對於某些重要蛋白，去除高丰度會影響這些重要蛋白是否表達差異確定。
（2） 關於精準醫療、標誌物研究的問題：在精準醫療、大資料分析的研究模式下，臨床樣本的分析方案，已經逐漸摒棄將組內樣本混合的模式，而是傾向於將每個樣本進行獨立的採集和分析。因為，這種模式能儘可能保留資訊的完整性、真實性，更有利於資料的有效分析和延展性挖掘。在這種大規模樣本的分析過程中，傳統的蛋白質組分析模式採用的大規模高丰度蛋白去除、大規模預分級實驗過程，不僅意味著巨大的實驗成本，更重要的是其對實驗操作的平行性是個巨大的挑戰（這些預處理過程造成的實驗誤差，是難以透過內標、演算法等方式校正回來的）。
為什麼要用DIA技術？
首先，不同於傳統蛋白質組的優先採集高強度訊號的DDA資料採集模式，DIA採用的全掃描採集模式，使得其受到高丰度訊號的影響大大降低。所以DIA在血液這種高丰度蛋白構成特點的樣本分析上，會更有優勢。越難的樣本，DIA越能發揮出技術特色。上海中科新生命的DIA平臺還對鐳射顯微切割的組織樣本進行過分析，其資料量也比常規方法提高0。5-1倍。其次，DIA所具備的高重現性、高準確性的特點，可以在大規模樣本分析過程中，儘可能地保證平行性和準確性，無疑是精準醫療、標誌物研究等大規模樣本分析專案的首選，這也是為什麼美國、瑞士、澳大利亞的精準醫療國家專案均採用DIA平臺的原因之一。
血液DIA的分析能力提高這麼多，可信度有多高？
對於血液DIA的分析能力一下子提高了這麼多，相信很多人肯定會產生疑問。所以我們已經對DIA資料設定了嚴格、高標準的“三重資料過濾”：protein FDR、peptide FDR和score值。其次，在分析平臺方面也進行了改進，主要包括以下兩方面：
色譜提升：一方面，在蛋白質組的分析流程中，色譜的重要性不亞於質譜，色譜的分離效果，直接影響質譜對訊號的採集效率。另一方面，質譜採集到的訊號，是否能夠用於定量，也需要滿足一定的色譜峰條件。色譜的穩定性，還直接決定了資料的重現性和準確性。
資料庫提升：質譜獲得原始資料只是圖譜與數字符號，資料庫搜尋過程決定了原始資料有多少可以變為真正有用的資料。DIA技術由於全掃描的採集方式，其原始資料的複雜性遠遠高於傳統蛋白質組技術，高度依賴於預先構建的圖譜庫對DIA的資料進行搜庫。由於我們是最早開展DIA分析的平臺，在已經積累了大量血液樣本質譜資料的前提下，已經構建成功獨有的血液樣本圖譜庫。專案開展過程中，不但會為每個專案構建其特有的圖譜庫，還會加上本平臺自有的血液圖譜庫，從而實現更高覆蓋度地對DIA資料進行分析。
總 結
在大規模樣本分析的情況下，除了DIA本身具有的高覆蓋度、高重現性和高準確性上的優勢外，其無需去除高丰度蛋白、無需進行預分級的優勢，最大程度地保證了實驗結果的真實性和平行性。在原有DIA分析體系的基礎上，升級的分析體系進一步實現了更深度的檢測，實現了資料量的進一步提升。
本文轉自：
分析測試百科網/BioArt
