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ChIP-seq可能同學們在做實驗的時候已經接觸到其對應的實驗技術ChIP了，那麼ATAC-seq具體原理是什麼，分析流程是什麼呢？今天我們就來學習
既往研究者針對ATAC-seq分析流程所發表的綜述
“
From reads to insight: a hitchhiker’s guide to ATAC-seq data analysis
”，於2020年發表在《Genome Biology》雜誌上。好，廢話不多說，我們直接開始解讀吧~
雖然前面提到了也要列在這裡的傳送門
〇、期刊資訊
一、研究背景
ATAC-seq(Assay forTransposase-AccessibleChromatin with high throughputsequencing)
於2013年首先開始應用以來，呈指數性增長趨勢（Figure 1a）。應用程度比其他DNA開放區域檢測技術相比更加普及。由於Tn5轉座酶的高反應性，只需要500-5000個細胞就可以進行分析。並且靈敏度和特異度和DNase-seq相當，由於FAIRE-seq，但後兩者技術對細胞數的要求更加苛刻。由於ATAC-seq並不需要非常嚴格的建庫標準，所ATAC-seq也能夠透過片段的長度識別核小體的位置。並且隨著FACS、微流體技術的發展，對於單細胞的scATAC0seq也得到開展，並對揭示臨床樣本以及發展生物學的細胞異質性具有重要作用。比如正在檢測正常造血以及白血病之間染色質可及性的變化。
（Figure 1a）
作者根據ATAC-seq資料分為四個步驟：
1.預處理（質控和比對）；
2.核心分析（peak鑑定）；
3.高階分析（peak註釋、motif分析、核小體分析、TF足跡）；
4.多組學整合分析（Figure 2）。
二、預處理（質控和匹配）
這一步包括3個小步驟
：（1）
比對前QC
；（2）
read比對
；（3）
比對後質控和處理
。
1.
質控
：首先比對前需要透過FastQC展示鹼基的質量，接下來透過trimmomatic進行去除已知的adapter序列。
2.
比對
：使用BWA-MEM或者Bowtie2對於短的雙端reads進行比對，成功率達到80%以上則認為是比較成功的。對於哺乳類動物，建議最少在開放染色質的區域為5000萬個reads，並且至少有200百萬TF的足跡。
3.
比對後質控
：得到比對後的BAM檔案後，線上粒體以及ENCODE上的blacklist區域的片段需要被移除（具有極高的read覆蓋率），另外因為PCR導致的高重複率同樣需要排除。
另外ATAC-seq特有的質控標準同樣需要評估，比如片段大小分佈圖（fragment size distribution）需要梯度式下降，分別是無核小體區（
（Figure 1b）
來自於無核小體區域的片段通常在轉錄起始位點（TSS）區域明顯富集，而核小體結合的區域則是在TSS位置訊號是缺失的，但是在兩側明顯富集（Figure 1C）。這些可以透過ATACseqQC進行評估。
（Figure 1C）
所以標準化的標準流程是：
FastQC
➔
trimmomatic
➔
BWA-MEM
➔
ATACseqQC
。
三、Peak鑑定（核心分析）
Peak鑑定在我們前面的推文中也提到過，主要是
對peak所對映的染色體位置資訊以及對應的基因
。類似於Chip-seq或者DNase-seq，ATAC-seq也推薦使用MACS2進行peak call。但是於Chip-seq不同的是，ATAC-seq不需要input作為control組進行對照。並且同時對無核小體區域片段以及核小體結合片段進行peak鑑定（Figure 3A）。並進一步透過平移延伸（shift-extend）的方式來對無核小體區域的peak進行平滑處理（Figure 3B）。
（Figure 3A,B）
目前流行的peak caller主要分為兩大類：
1.基於count
2.基於shape 的peak caller。
前者包括MACS2、HOMER等，後者包括PICS、PolyaPeak等。
ATAC-seq主要適用於前者（Figure 4）。其中ATAC專屬的HMMRATAC計算效果比MACS2和F-seq效果都要好，並提供了額外的核小體位置資訊。
（PS:這裡作者推薦一般來說使用MACS2和HOMER進行peak calling。如果計算資源充足，則可以考慮HMMRATAC）
四、ATAc-seq高階分析
peak相關高階分析
1
peak的差異分析
現目前並沒有專門為ATAC-seq涉及的差異peak分析工具，目前的差異分析工具根據分析方法同樣分為兩類，分別是1。consensus peak和2。sliding window-based。對於前者包括HOMER、DBChip、DiffBind依賴於RNA-seq差異分析所需要的包，比如edgeR、DEseq2所作的分析。其中DiffBind或者DBChIP具有交集或者union的選項。後者包括ChIPDiff、PePr等等（Figure 4）。
（Figure 4）
2
peak註釋
獲取到peak的集合之後，註釋peak可以使用HOMER、ChIPseeker、ChIPpeakAnno等工具。這些工具能夠將peak對映到最近的基因以及對應的基因區域，並且可以透過餅圖的方式展示註釋的基因特徵（Figure 1D），除此之外還可以進行GO、KEGG等功能註釋。
motifs分析
雖然ATAC-seq能夠對peak進行註釋以及相關的功能富集分析，但是並不能對潛在機制進行解讀。而motif則是TF和DNA結合的特定序列，TF所結合的特定位點則是TFBS（TF binding site）。大部分TF結合在染色質開放區域，但是少數的pioneer TF則能夠結合到並不完全開放的區域。而轉錄因子結合的位點能夠導致片段在這一區域富集水平相對下調，從而形成TF足跡（footprint）。人類大概有1600多個TF，其中超過一半透過實驗和計算獲得對應的motif。TF透過和組蛋白以及非組蛋白競爭結合到DNA上發揮轉錄調控作用。目前有兩種對於motif分析的方法：1。基於序列的預測進行motif的頻率以及活性預測；2。footprint去計算TF的佔有率。
1
motif資料庫以及篩選
目前普遍使用的資料庫包括JASPAR等資料庫，motif以文字的格式儲存為PWM的形式。HOMER以及R包TFBSTools、motifmatchr能夠透過PWM給定的核苷酸序列搜尋對於潛在的TF結合位點。而MEME和PWMScan由於它的網路互動頁面所以具有更好的使用體驗。
2
motif的富集和活性分析
透過前面的motif搜尋工具，每個peak區域的motif的位置和頻率資訊就有了，接下來可以透過HOMER或者MEME-AME進一步計算TF的出現頻次和活性，並和背景訊號進行比較，從而推測轉錄因子的活性。除此之外，還包括ChromVAR能夠計算每個motif在多個分組中的可及性，並用Z score的方式進行評分（這是專門為scATAC-seq資料設計的分析）。
3
TF足跡（footprint）分析
另一個評估TF調控的方式則是footprint。Footprint是因為TF結合在DNA上阻礙了Tn5酶的剪下，從而留下了開放染色質區域種的一個相對缺失（波谷）。但是目前對ATAC-seq的分析是存在障礙的：（1）首先在預處理的時候需要移動原始read，由於具有 9個鹼基的重複；（2）由於Tn5的親和力很強，並且TF短暫結合具有較弱的結合能力。所以footprint並不容易檢測。因此footprint檢測並不準確。
目前分析footprint的工具包含兩類：（1）de novo以及（2）motif-centric方法（Table 1）。前者基於footprint的特點模式（peak-dip-peak）進行預測，接下來則透過推定的footprint位點與已知的motif進行聯絡或者是驗證發現新的motif。後者則是基於先驗的TFBS並且透過監督以及無監督的方式區別這些位點是否是結合的。De novo tools方法包括HINT-ATAC校正了鏈特異性的Tn5剪下偏倚。Motif-centric tools這類方法作者推薦BaGFoot工具，能夠計算footprint depth並且對測序深度以及偏倚進行校正。總地來說作者推薦HINT-ATAC工具。
核小體位置分析
核小體由組蛋白形成的八聚體以及147bp的DNA構成。在ATAC-seq分析種，更長的DNA片段通常是由於核小體相關的區域導致的。但是檢測出核小體的覆蓋率要低於MNase-seq。HMMRATAC and NucleoATAC是兩個最常用的ATAC-seq核小體檢測的方法。
五、多組學資料整合分析構建調控網路
1
ChIP-seq資料整合
由於開放染色質同上是TF結合的前提，所以ATAC-seq peak通常與TF的ChIP-seq進行重疊，但是前者的範圍更廣。所以兩者可以相互驗證。只在TF的ChIP-seq中存在的peak才可以視作為pioneer TF結合到關閉的染色質範圍上。對於ATAC-seq的motif和TF足跡分析能夠進一步整合到真實的TF的ChIP-seq中，從而降低假陽性率。同樣ATAC-seq能夠和組蛋白的ChIP-seq進行分析，並找到組蛋白對於染色質的開放促進還是抑制作用（與開放區域轉錄正相關，如H3K4me3， H3K4me1， H3K27ac等，以及與開放區域轉錄負相關，如H3K27me3）
2
RNA-seq整合
差異基因同能能夠逆向推定上游的TF，並找到在開放染色質特定的footprint和motif。通常是scATAC-seq和scRNA-seq的聯合。
3
構建regulatory網路
這裡最常使用在scATAC-seq分析，比如Cicero包進行的STAC-se增強子-基因調控網路（Figue。 3C）。
好啦，關於ATAC-seq的綜述就講解到這裡啦，我是風間琉璃，我們下期見~
—END—
撰文丨風間琉璃
排版丨四金兄
主編丨小雪球
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