2022年11月30日，現任復旦大學腦科學轉化研究院青年研究員
袁鵬
與美國耶魯大學
Grutzendler
團隊合作於
Nature
線上發表文章“
PLD3 affects axonal spheroids and network defects in Alzheimer’s disease
”
【1】
，
發現阿爾茨海默症中β-澱粉樣蛋白沉積周圍存在大量的軸突球狀體的膨大病變結構，它們阻礙神經訊號傳導，影響神經網路功能，而溶酶體蛋白PLD3可以作為調控此病變的分子靶點。
阿爾茨海默病
（AD）患者記憶力和認知功能持續惡化，存在廣泛的神經迴路阻斷和網路連線異常。β-澱粉樣蛋白（Aβ）沉積形成細胞外斑塊被認為會引發一系列病理過程，最終導致認知障礙。然而Aβ沉積與神經網路障礙之間確切的細胞機制依然不清楚。在病人或轉基因小鼠的腦組織中，均可觀察到Aß沉積周圍存在明顯增大的神經元突起（圖一），而這一AD的標誌性病理還沒有得到足夠研究。針對這一病理，本研究透過高質量的結構成像、活體鈣成像、電壓成像、計算建模及基因編輯等方法對其進行了結構和功能解析。
圖 1 阿爾茨海默病人及小鼠模型腦中的軸突球狀體。左圖：免疫熒游標記的阿爾茨海默病人腦中的神經纖維蛋白SMI-312；右圖：在5xFAD小鼠中透過腺病毒介導的在澱粉樣沉積周圍的神經束標記。
這一病變結構傳統上稱為營養不良性神經突（dystrophic neurites），被認為是軸突損傷後的退行性結構。然而，利用長時程活體雙光子成像追蹤，作者發現該結構在數月中保持穩定，而且它所在的母軸並不萎縮消失，但是其大小呈現動態變化，大部分突起在觀察的數月時間中體積增大，不過也存在縮小或消失，提示該病變可能與軸突長期共存，從而可能對於軸突的功能造成持久的影響。為了區分這類病變與萎縮中的退行性結構的區別，在文中作者將它們稱為斑塊相關軸突球狀體（Plaque associated axonal spheroids， PAAS）。對5xFAD小鼠（AD模型小鼠）和AD患者腦片染色可以看到澱粉樣斑塊周圍有大量的PAAS，平均一個斑塊就影響數百個軸突。考慮到AD腦中有數量眾多的澱粉樣斑塊，每個受影響軸突又牽涉它上下游的環路，PAAS對軸突功能的影響可牽涉大片神經網路。
為探究PAAS對於軸突傳導功能的影響，作者利用活體鈣成像技術，觀察軸突中的鈣訊號以評估傳導功能。作者發現，當軸突臨近Aß沉積時，其傳導功能並未受到影響，而若軸突形成了球狀體病變，其兩側中的鈣訊號存在明顯延遲，並且相關性顯著降低，說明球狀體病變阻礙了正常的軸突訊號傳導。作者又進一步採用了AAV-ASAP3病毒進行了活體電壓成像，發現在同等刺激強度下，5xFAD小鼠相比對照組小鼠存在更高的機率傳導失敗。透過對軸突上動作電位的傳導過程的生物物理學建模，作者認為軸突球狀體較大的表面積起到了電容的效應，對於動作電位來說就像電流阱（current sink），從而導致了傳導阻滯或延遲（圖二）。與模型的預測相一致，作者觀察到軸突球狀體的大小是軸突傳導障礙效應的決定性因素，該病變的大小越大，對於傳導的影響也越嚴重。
圖 2 軸突球狀體阻斷動作電位的傳導。左上圖：單軸突中活體鈣成像的相關性熱圖。形成軸突球狀體後，軸突兩端GCaMP熒光訊號相關性顯著降低。右上圖：活體電壓成像可見5xFAD鼠中更易出現訊號傳導的阻斷。下圖：依據生物物理學模擬軸突球狀體對於傳導的影響。透過輸出端收到的訊號數目和延遲來評判軸突傳導的功能。
透過對病人大腦的定量分析，作者發現與輕度認知障礙患者相比，中度至重度AD患者中的軸突球狀體的數量更多，尺寸也更大。這些發現
提示了軸突球狀體的數量和大小可能是決定AD患者神經迴路受損程度和認知缺陷的重要因素。
作者進一步解析了控制軸突球狀體增大的細胞水平機制。高解析度共聚焦成像和膨脹顯微成像發現，老齡5xFAD小鼠和AD病人腦中，軸突球狀體內大型LAMP1陽性囊泡（Enlarged Lamp1 positive vesicle， ELPV）增加，球狀體大小與異常ELPV數量高度相關，ELPV積聚可能是球狀體膨大的重要特徵。ELPV可能包括多囊體（MVB），內溶酶體和自溶酶體。染色結果還發現，PLD3蛋白存在於ELPV中，並且在軸突球狀體中高度富集。PLD3是AD風險基因
【2】
，編碼一種溶酶體駐留蛋白，在MVB的生成中發揮作用，可能進而影響MVB相互作用的各種細胞器。作者推測可能是PLD3積聚引起ELPV積聚，驅動球狀體膨脹，造成傳導障礙。於是，作者在5xFAD小鼠皮層注射AAV-PLD3，使神經元過表達PLD3，這引起了ELPV數量和大小增加，以及軸突球狀體的體積增大，說明PLD3的積累與球狀體增大的機制相關。
作者接著又探究降低PLD3水平是否會改善軸突球狀體病理。根據CRISPR-Cas9基因編輯技術設計針對PLD3的打靶sgRNA，作者給3月齡或者7月齡5xFAD小鼠注射AAV-sgRNA，刪除神經元中的PLD3。這種在澱粉樣蛋白沉積的早期或後期治療，均顯著降低了大型ELPVs的豐富度，縮小了軸突球狀體的尺寸，而澱粉樣斑塊的數量與大小沒有顯著變化。作者又結合PLD3敲除與鈣成像，觀察到PLD3敲除後，動作電位的神經傳導也有顯著改善。因此，PLD3的減少可以遏制斑塊附近軸突球體的發展和恢復軸突傳導特性（圖三）。
圖 3 治療軸突球狀體可恢復AD小鼠中的傳導和神經網路活動異常。左圖：利用AAV病毒敲低或過表達PLD3可以減輕或加劇軸突球狀體的病變，並與軸突上的傳導障礙相對應。右圖：透過敲低PLD3基因減輕基底前腦神經元上的軸突球狀體，在5xFAD小鼠中可改善下游皮層中神經元的異常發放。
最後，作者探究了減少軸突球狀體是否能改善神經迴路功能。基底前腦區在AD早期就受影響，它是膽鹼能遞質的主要來源，泛投射到皮層中間神經元，對突觸後的皮層神經元起到複雜的調控作用，對認知功能十分重要。作者將AAV-sgRNA注射到5xFAD小鼠基底前腦區敲除PLD3，在其下游皮層注射AAV-GCaMP6f並進行鈣成像。未受治療的5xFAD小鼠呈現出過度活躍及高度同步化等一系列的異常皮層神經活動模式，與前期研究報道一致
【3】
。而接受治療的小鼠逆轉了神經迴路的異常，神經網路功能與野生型小鼠相近。
這項研究描述了一種阿爾茲海默症中發生認知障礙的新機制。作者發現澱粉斑塊周圍的存在大量軸突球狀體結構，它們就像電流阱一般阻礙神經訊號傳導，嚴重影響神經網路功能，球狀體越大傳導受損越嚴重。隨後作者找到神經元溶酶體蛋白PLD3作為調控此病變的分子靶點，能逆轉球體狀病變和神經傳導異常，指出了AD治療中一類不依賴澱粉樣蛋白清除的潛在新策略。
袁鵬課題組目前正積極招聘青年副研究員，詳情見課題組網站：https：//itbr。fudan。edu。cn/info/1593/3134。htm
原文連結：
https：//doi。org/10。1038/s41586-022-05491-6
參考文獻
1。Yuan， P。 et al。 PLD3 affects axonal spheroids and network defects in Alzheimer’s disease。
Nature
（2022）。 https：//doi。org/10。1038/s41586-022-05491-6
2。Cruchaga， C。 et al。 Rare coding variants in the phospholipase D3 gene confer risk for Alzheimer’s disease。
Nature
505， 550–554 （2014）。
3。Busche， M。 A。 et al。 Clusters of hyperactive neurons near amyloid plaques in a mouse model of Alzheimer’s disease。
Science
321， 1686–1689 （2008）。
