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小夥伴們，大家好，我是麥麥。今天帶給大家的是一篇今年發表於Nature子刊的文獻解讀，本篇論文於2020年2月發表在1區Top醫學期刊Nature medicine上，最新影響因子：
53.44
。題目是“Development of a human skin commensal microbe for bacteriotherapy of atopic dermatitis and use in a phase 1 randomized clinical trial”。來自加州大學聖地亞哥分校醫學院的研究人員發現從健康的人類面板中分離出來的一株共生菌表皮葡萄球菌 A9（ShA9），可治療特應性皮炎（溼疹的一種）。
期刊簡介
研究背景
特應性皮炎（Atopic dermatitis；AD）是一種常見的面板疾病，以劇烈瘙癢和溼疹樣皮損為主要特徵。全球兒童患病率為 15%至20%，成人為1%至3 %。研究發現大量金黃色葡萄球菌定植於AD患者面板表面，並透過促進炎症加劇疾病程序。正常人類面板表面微生物群落相互依存又相互制約可維持面板、黏膜表面的菌群平衡。一些與面板共生、血漿凝固酶陰性菌株（CoNS）產生的細菌素可以選擇性地抑制面板表面上的非常駐致病菌，如金黃色葡萄球菌、A 組鏈球菌和大腸桿菌的生長繁殖。
本研究中作者從健康受試者的面板中篩選出一種CoNS菌株—人葡萄球菌A9 （ShA9），發現ShA9有效殺滅小鼠面板上的金黃色葡萄球菌，並抑制了金黃色葡萄球菌中促進炎症的毒素（psmα）的表達。本研究一方面採用臨床前AD小鼠實驗模型來評估ShA9潛在的治療作用及其機制，並進行了隨機雙盲對照的臨床試驗進一步考察其對AD患者的安全性及有效性。
文獻解讀
1
人體面板共生菌中有益菌的篩選及臨床前實驗
從健康受試者的面板中篩選出8000多株CoNS細菌，並從中篩選出能夠抑制金黃色葡萄球菌生長的菌株，然後進一步評估了這些菌株的其他特性，比如恢復受損面板屏障的能力，對常見的抗生素敏感，對金黃色葡萄球菌抑制的選擇性等。基於這些標準，作者最終選擇人型鏈球菌 （ShA9） 菌株用於 AD小鼠模型的臨床前研究。
透過一天兩次塗抹卵清蛋白（OVA）溶液致敏並與金黃色葡萄球菌定植3天建立AD小鼠模型，然後在背部塗抹ShA9 菌株3天，觀察其療效。如圖1所示：
圖1
1。 ShA9能夠抑制金黃色葡萄球菌的存活，並有效改善面板表面區域性紅斑現象（圖1a）
2。 皮損評分（g）和經皮失水率TEWL（h）也顯著性降低（圖1b）
3。 ShA9能夠抑制AD炎症反應，有效降低IL-4、IL-13、TSLP、IL-17、IL-22等與AD密切相關的炎症因子的水平（圖1c）
此外，由於TH2細胞因子如IL-4和IL-13的抑制作用，AD患者某些宿主防禦肽的相對錶達水平較低，應用ShA9可增加抗菌肽Camp（圖1d）， mDB14（圖1e） 和 mBD4（圖1f）的mRNA的表達。表明ShA9除了具有直接抗菌作用外，還能增強宿主的抗菌防禦系統。
2
ShA9的抗炎活性不依賴於殺死金黃色葡萄球菌
已有文獻發現，ShA9可產生兩種對金黃色葡萄球菌具有抑制作用的活性的羊毛硫抗生素（隸屬於抗菌肽）。為了研究在區域性應用ShA9後觀察到的抗炎活性是否依賴於殺死金黃色葡萄球菌，透過等位基因交換刪除了ShA9中的兩個羊毛硫抗生素基因。如圖2所示，
圖2
1。 與野生型（WT）ShA9 相比，突變型ShA9菌株（ShA9-Δlanti）在瓊脂上的生長良好，表明野生型的ShA9能殺死金黃色葡萄球菌，而突變型ShA9菌株卻不能（圖2a）
2。 突變型ShA9 菌株（ShA9-Δlanti）與ShA9的WT親本菌株的效果比較顯示，ShA9-Δlanti 抑制金黃色葡萄球菌在小鼠面板上繁殖的能力大大降低（圖2a）
突變體ShA9 菌株不能有效殺死金黃色葡萄球菌，但保留了其抑制炎症反應的能力，IL-4（圖2c）、IL-13（圖2d）、IL-17（圖2e）的mRNA表達水平都降低，恢復了 Camp 的表達（圖2f），並且能夠抑制Th2和Th17細胞的浸潤（圖2g-i）。另外，作者發現突變ShA9-Δlanti 菌株與野生菌株在抑制酚溶調控蛋白-α（PSMα） 的mRNA 表達方面作用相當（圖2j），PSMα是一種受群體感應控制並促進面板炎症的金黃色葡萄球菌毒素。圖2的結果表明，突變型ShA9-Δlanti菌株儘管不抑制金黃色葡萄球菌的生長，但仍能抑制炎症反應，保留了其抑制群體感應的能力。
3
ShA9對AD患者面板的安全性評價
基於以上觀察結果，作者提出ShA9 可以透過三種機制發揮緩解AD作用（圖3a）：
1。 直接殺死金黃色葡萄球菌
2。 抑制群體感應（群體感應是細菌根據細胞密度進行基因調控的一種生理行為，能夠改變細菌的毒力基因的表達等）
3。 促進其他共生體的保護功能
圖3
圖3b是對金黃色葡萄球菌定植的 AD 成人患者區域性應用ShA9的臨床研究方案設計。
作者以人體安全性作為主要終點，設計了一項1期隨機、雙盲、對照的臨床試驗，納入54名成人中重度AD患者，面板金黃色葡萄球菌感染陽性，其中36人接受ShA9治療，18人作為對照。在7個時間點取面板拭子：分別是第1天第一次塗抹之前和之後的1h，在給藥的第4天和第7天，第7天最後一次給藥後的24、48和96h。
表1
表1顯示了AD 成人患者區域性應用ShA9在8天內不良反應發生率。ShA9治療組的總不良反應發生率是55。6%，安慰劑對照組不良反應發生率達到83。3% （P = 0。044）。
表2
表2顯示的是主要的不良反應評判事件有eczema（溼疹）、pruritus（瘙癢）、pain in extremity（四肢疼痛）、peripheral swelling（腫脹）、abdominal pain upper（上腹痛）、abdominal discomfort（腹部不適）、furuncle（癤子，金葡菌引起的化膿性感染）、dysmenorrhea（痛經）等。
4
ShA9對AD的區域性治療效果及原理
圖3c-j表明，區域性應用ShA9可減少AD患者金黃色葡萄球菌的定殖，AD患者區域性炎症的改善與ShA9殺滅金黃色葡萄球菌相關。
圖3
（圖3c）皮損區和非皮損區7個時間點面板表面葡萄球菌的數量。ShA9 減少了AD患者病變和非病變面板上金黃色葡萄球菌菌落形成單位。
由於ShA9的抗菌活性對某些金黃色葡萄球菌菌株具有選擇性，包括對AD26的臨床分離株的選擇性，因此作者還測量了從每位參與者基線拭子中回收的金黃色葡萄球菌的分離株對體外ShA9的敏感性。大多數個體都被對ShA9抑制生長敏感的金黃色葡萄球菌菌株定殖。在第7天和隨訪階段，參與者對面板殺死的敏感性與參與者面板上金黃色葡萄球菌丰度的變化有關。透過相關性分析，分析了面板表面的金黃色葡萄球菌丰度與ShA9的敏感性之間的關係（圖3d）。
接下來作者從AD患者身上回收了沒有被ShA9殺死的金黃色葡萄球菌，多肽耐藥因子（mprF）是一種由金黃色葡萄球菌表達的基因，之前已報道該基因抑制抗菌肽（AMP）的表達。與野生型金黃色葡萄球菌相比，敲除mprF的金黃色葡萄球菌組（ΔmprF）對ShA9敏感性更強（圖3e）。
而從AD患者中分離出的金黃色葡萄球菌中mprF的表達量更高，則對ShA9的抗菌活性更具耐藥性（圖3f）。
對ShA9敏感或耐藥的金黃色葡萄球菌定植的AD患者皮損表面金黃色葡萄球菌mprF mRNA的丰度（圖3g）。對ShA9耐藥的金黃色葡萄球菌定植的AD患者損傷面板中mprF的mRNA表達量更高。這些資料表明，金黃色葡萄球菌的 mprF表達會影響 ShA9 直接抑制金黃色葡萄球菌存活的能力。
相關性分析圖展示的是ShA9抑制敏感的金黃色葡萄球菌生長的能力和溼疹改善評分之間的關係（圖3h），可以看到ShA9的殺菌能力越強，患者溼疹改善越好。
圖3i和圖3j是做的7個時間點的EASI和SOORAD評分變化曲線，可以看到對ShA9敏感的AD患者，溼疹評分顯著降低的，並且這種作用持續到了末次給藥後的96h。這些觀察結果支援金黃色葡萄球菌在AD 發病機制中的作用，並表明區域性應用合理的人類共生菌可以使部分AD 患者受益。
5
ShA9在病變區面板上的存活和轉錄活性
接下來作者研究了ShA9改善AD第二個機制——ShA9對群體感應的作用（圖4）。首先是評估了ShA9在面板上的永續性，透過測量總CoNS 的菌落計數作為 ShA9丰度的替代測量。
圖4
在圖4a中，作者分別檢測了皮損和非皮損部位的有益菌CoNS的丰度。可以看到在第一次應用ShA9 後1小時，損傷和非損傷面板均顯示面板上的活CoNS 增加3到4個對數，對照組沒有變化。接受 ShA9 治療的參與者在第4天和第7天非病變面板上 CoNS 數量更多。有趣的是，即使在最後一次應用後 96 h，在非病變面板上仍檢測到更高水平的CoNS菌株。
圖4b記錄了病變面板中AIP（自誘導肽）mRNA的表達 。為了評估ShA9的轉錄活性，可以看到AIP（自誘導肽）和抗菌肽這兩個基因的mRNA水平都明顯升高，在治療後96h也維持在較高的水平。雖然區域性應用ShA9 1h後皮損區有益菌的丰度就開始降低了，但是ShA9代謝產物在病變區和非病變區都能維持在較高水平。
金黃色葡萄球菌的重要毒力因子psmα（圖4c），它是群體感應下游的一個毒素，它的表達和AIP的表達是呈負相關的，經過治療之後psmα的表達下降。
圖4d是評價了psmα和EASI評分之間的相關性，可以看到在ShA9治療組中，區域性EASI評分的改善與金黃色葡萄球菌psmα表達降低有關。
接下來作者建立了小鼠AD模型來驗證ShA9對psmα的抑制作用是否與殺死金黃色葡萄球菌有關（圖4e），小鼠分別用高表達和低表達psmα的金黃色葡萄球菌來定植，採用ShA9區域性治療後，ShA9並沒有殺死高表達psmα的金黃色葡萄球菌，但是卻大大減少了低表達psmα金黃色葡萄球菌的定植。
圖4f-i展現的是病變背部面板中psmα（圖4f）、IL-4（圖4g）以及Camp（圖4i）mRNA的表達水平，以及在每組（i）中觀察到的面板炎症請情況。不管金黃色葡萄球菌是高表達psmα還是低表達psmα，ShA9都能降低psmα和IL-4的表達水平，同時恢復Camp的表達。也改善了由金黃色葡萄球菌定植導致的炎症反應。
這些資料表明這些資料表明，ShA9 的應用透過抑制群體感應系統對抗金黃色葡萄球菌定植，並且這種保護作用與ShA9這可以獨立於ShA9羊毛硫抗生素直接殺死金黃色葡萄球菌。
6
ShA9對AD面板微生物群的選擇性
最後作者探究了ShA9促進其他面板共生群的影響（圖5）。為了研究 ShA9 對 AD 病變面板整體細菌群落的影響，作者對16S核糖體RNA基因的 V1-V9 進行了全長測序。
圖5
細菌組學分析發現在ShA9治療組中（圖5a），金黃色葡萄球菌的序列讀取頻率大大降低（黃色），並擴大了人型葡萄球菌的比例（綠色）。
主成分分析（圖5b）表明，與對照組比較，ShA9組在治療後96h的微生物組成發生了明顯改變。
減去人型葡萄球菌後，顯示了局部應用ShA9組或對照組面板細菌種類的相對比例（圖5c-d）。ShA9治療增加了表皮葡萄球菌的比例（藍色的），對照組中並沒有出現。
圖5e和圖5f是金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌所佔的比例，表皮葡萄球菌增加的比例要高於金黃色葡萄球菌降低的比例。
面板菌群的結果表明區域性應用ShA9 可能促進其他CoNS物種（有益菌）在AD病變面板上的重新定植。
總結
作者在結論部分提出採用共生微生物治療AD的新方法在1期隨機臨床試驗中顯示是安全且有效的， 有效避免了類固醇和其它靶向作用宿主機體免疫系統的藥物所產生的副作用。並且區域性應用 ShA9 後，耐藥的金黃色葡萄球菌也未被檢測到。當然也需要進一步研究以評估這種方法對AD患者進行細菌治療的長期風險和益處。
採用細菌療法治療疾病並不是特別新奇的點，癌症、結腸炎等疾病中均有相關的報道。而採用透過篩選面板表面的有益共生微生物來治療面板疾病，
創新點強
。並且，作者在前期動物實驗上進行了
深入的機制探討
，1期臨床試驗上也進行了
安全性和有效性的初步驗證
，
有較強的實際應用價值
，想必這也是它能被nature子刊接收的重要原因！這篇論文的確是高分臨床文章的代表性佳作。
參考文獻：Nakatsuji T， Hata TR， Tong Y， et al。 Development of a human skin commensal microbe for bacteriotherapy of atopic dermatitis and use in a phase 1 randomized clinical trial。 Nat Med。 2021， 27：700-709。
—END—
撰文丨麥麥
排版丨豨薟
國慶節的祝福，就不給你整虛的！
做科研5年了，會做多少實驗，發表多少篇SCI才算正常水平？
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