間充質幹細胞（mesenchymal stem cells， MSCs）是21世紀最有潛力的幹細胞治療工具之一， 目前有關MSCs的臨床試驗涉及上百種疾病由於其細胞產品的異質性很強， 臨床治療效果的批次差異很大， 因此間充質幹細胞的功能最佳化及產品質控是目前細胞治療中的研究重點
通常從供體中分離的細胞數量有限， 為了獲得足量的細胞用於臨床治療， 不可避免地要將MSCs進行體外擴增培養然而， 長期體外培養會導致細胞的複製性衰老， 細胞的免疫表型旁分泌造血支援和免疫調節等生物學特性和功能皆會發生改變MSCs產品的質量控制和製備監管是確保其生物安全性和有效性的關鍵， 充分了解細胞在體外製備和擴增中發生的生物學變化對臨床轉化和新藥研發具有重要意義
細胞形態和增殖活力
體外培養初期， MSCs多呈紡錘形豐滿立體， 有大量均勻分佈的微絨毛， 而至培養的中後期（第11代和第17代）， 細胞變得更寬大， 扁平， 並伸出大量的偽足， 微絨毛的數量和長度也減少MSCs在長期體外培養過程中， 在第9代前表現出類似水平的增殖能力， 10代之後的MSCs增殖能力則顯著下降， 這種增殖能力的下降與細胞端粒長度和線粒體活性的變化無關同時研究者觀察到， G0 /G1期細胞比例在培養過程中的逐漸增加， S期細胞比例逐漸減少； 在長期培養的後期細胞內出現較高的ROS水平， 這可能是細胞在複製分裂過程衰老的主要表現。
分化能力和歸巢能力
分化能力和歸巢能力
最近的一些研究評估了MSCs分化後的成骨和成脂標誌物的相對錶達情況， 認為MSCs成骨和成脂能力會隨著體外培養擴增而逐漸降低
LOHM-ANN等
［1］
研究表明， 衰老的MSCs的成骨分化傾向增加， 成脂分化潛能降低KIM等
［2］
則認為MSCs的成脂和成骨分化能力皆顯著下降
MSCs會表達許多黏附受體和趨化因子， 有助於其遷移到炎症部位起到修復和支援作用僅培養了24小時的原代MSCs在移植後歸巢能力減少到未培養狀態的10%許多論文報道了MSCs在體外擴增培養過程中黏附和遷移能力下降， 可能與衰老細胞分泌的細胞因子調控有關轉錄組分析結果顯示， 在長期培養的MSCs中， 參與局灶黏附組織和細胞骨架翻轉的基因表達下調， 多種與細胞遷移相關的趨化因子細胞因子及其受體的mRNA表達下調
免疫表型於免疫調節功能
體外培養的間充質幹細胞缺乏特異性和獨特的標記物普遍認為， 人類MSCs不表達造血標記物CD45CD34和CD14或共刺激分子CD80CD86和 CD40， 而表達不同水平的 CD105CD73和CD90MSCs上的標記也可能會因不同的分離培養和擴增條件或譜系分化而改變
有研究表明， 長期體外傳代會使原本表達陽性的MSCs標記訊號逐漸減弱（如CD271和VCAM-1）， 也會使CD73和CD146表達上調， 但也有研究指出在體外培養到第15代的人臍帶來源的MSCs表面標記表達沒有改變， 這些實驗的差異可能與細胞本身的異質性有關
研究發現， 儘管MSCs的表面標記物和分化能力在人臍帶源性MSCs培養到第15代時保持不變， 但其對調節性T細胞的促進作用以及對Th1/Th17的抑制作用顯著下降有趣的是， 如果將同一條臍帶分多次分離MSCs進行培養， 晚期分離的MSCs免疫調節能力反而增強。
免疫表型於免疫調節功能
研究發現， MSCs的培養液也能起到和細胞輸入相似的治療效果， 但有效的培養液製劑也需要大量的MSCs培養擴增普遍認為， MSCs透過旁分泌生長因子抗炎細胞因子抗菌肽細胞器（即線粒體）， 以及細胞外囊泡等來行使免疫調節抗炎營養支援血管生成調節和抗凋亡功能
研究表明， 微環境對MSCs的旁分泌功能影響很大， 特別是在體外培養過程中， 衰老的人源MSCs會分泌大量的IL-6和IL-8等炎症因子DI等
［3］
也證明了體外衰老的人源MSCs幾種炎性細胞因子包括IL-6IL-8趨化因子8和粒細胞–巨噬細胞集落刺激因子金屬蛋白酶3和細胞間黏附分子（inter cellular adhesion molecules， ICAM）-1表達水平顯著增加另有研究表明， 第9代的MSCs表達PGE2，COX-2和HGF水平都顯著低於第3代的MSCs， 這也說明， 傳代培養中細胞的抗炎因子的旁分泌有所下降MSCs培養中氫氣的處理會增加成纖維細胞生長因子和HGF的分泌， 而降低了血管內皮生長因子的分泌這提示， 在MSCs產品的製備過程中可以透過改善培養環境有針對性地生產我們需要的細胞
旁分泌功能
旁分泌功能
大量研究明確了在MSCs在體外培養的過程中，細胞的基因組轉錄組以及甲基化組等方面都發生了很大的變化SCHALLMOSER等
［4］
的研究發現，在不同的體外培養條件下， 參與細胞分化凋亡和死亡的基因表達逐漸上調， 而參與細胞有絲分裂和增殖的基因表達下調
WAGNER等
［5］
報道， 參與細胞週期DNA複製有絲分裂和DNA修復的基因表達水平在傳代後期中顯著降低；與DNA複製細胞週期調節DNA修復成脂分化以及脂肪酸代謝過程等過程相關基因的甲基化程度增加
分子生物學變化
分子生物學變化
目前將MSCs應用於臨床研究的疾病有上百種，它可以用於改善梗死後的心功能修復骨和軟骨缺損治療神經退行性疾病以及幫助造血恢復治療或預防移植與宿主疾病等
ZHAO等
［
6
］
的研究發現， 高代次的臍帶MSCs在體外表現出血液支援能力的受損， 並且在體內治療急性移植物抗宿主病的作用下降，這可能是由於MSCs的旁分泌能力和歸巢能力受損所致在治療急性肝衰竭大鼠的研究中，第10代臍帶MSCs組與第5代MSCs組相比， 低代次MSCs能更有效地促進肝細胞再生， 抑制細胞凋亡，而高代次細胞移植後歸巢到肝臟的效果較差目前的研究都比較支援10代之前的細胞具有較為穩定的治療效果
已經有很多臨床試驗證明， 大劑量輸入MSCs沒有發生顯著的副作用或不良事件發生， 這都證明了體外培養的MSCs應用與臨床是相對安全的然而， 探索最佳化MSCs治療有效性和安全性尚且任重道遠， 應嚴格管理細胞培養環境，最佳化培養條件， 持續進行幹細胞基因組完整性及癌基因的檢測， 儘可能降低其在體外培養階段的惡變風險
間充質幹細胞治療在臨床應用中具有廣闊的天地， 細胞製備的標準化方案和質量控制是臨床轉化的先決條件。目前由於取材方式、培養條件、儲存方法， 以及供體差異等各種原因導致MSCs的批次間差異很大， 如何保持MSCs功能的一致性？如何挑選出功能優勢的細胞亞群？如何對抗細胞的生長阻滯和衰老？如何過濾體外擴增後的衰老細胞？傳代過程中有怎樣的細胞亞群變化？這些問題都需要我們投入更加深入的研究。為此， 必須建立更加嚴格的MSCs質量控制標準， 確保幹細胞治療的可重複性、安全性和有效性。
